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ELISA實(shí)驗(yàn)中的顯色過(guò)程是通過(guò)酶催化無(wú)色底物生成有色產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)過(guò)程涉及幾個(gè)關(guān)鍵步驟和注意事項(xiàng)： 

1、顯色原理：

1) 酶催化：在ELISA中，通常使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）作為標(biāo)記酶。HRP催化底物如TMB或OPD的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。

2) 底物選擇：常見(jiàn)的底物包括TMB（生成藍(lán)色產(chǎn)物，終止后轉(zhuǎn)為黃色）和OPD（直接生成橙黃色產(chǎn)物）。

3) 顯色反應(yīng)：加入底物后，HRP催化無(wú)色底物變成有色產(chǎn)物，反應(yīng)隨時(shí)間加深。

2、顯色條件：

1) 溫度：適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色，但需注意不要過(guò)高，以免影響反應(yīng)平衡。

2) 時(shí)間：定量測(cè)定中，顯色時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)確控制，通常在20-30分鐘內(nèi)達(dá)到峰值。定性測(cè)定可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短，視顯色情況而定。

3) 避光：OPD底物液應(yīng)避光進(jìn)行顯色，而TMB受光影響較小，但保持穩(wěn)定時(shí)間。 

3、顯色終止：

1) 終止液：使用酶抑制劑如疊氮鈉或SDS終止顯色，或用酸性溶液使TMB由藍(lán)轉(zhuǎn)黃，便于吸光度測(cè)定。

2) 讀取時(shí)間：顯色結(jié)束后應(yīng)及時(shí)讀取吸光度，避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間顯色導(dǎo)致信號(hào)減弱。

4、比色操作：

1) 吸水紙拭干：比色前確保板底無(wú)多余液體。

2) 比色架放置：正確放入比色架中，如果是軟板，需先放于標(biāo)準(zhǔn)96孔座架中。

3) 空白對(duì)照：先測(cè)讀空白孔和底物孔，以校準(zhǔn)讀數(shù)。

4) 吸光度計(jì)算：吸光度值需減去空白孔的吸光度，再進(jìn)行計(jì)算。

5、顯色偏淡的解決方法：

1) 孵育條件：確保孵育溫度和時(shí)間準(zhǔn)確，避免溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短。

2) 試劑濃度：檢抗和酶濃度需按說(shuō)明書(shū)配比，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響顯色。

3) 樣本平衡：從冰箱取出的試劑和樣本應(yīng)充分平衡至室溫。

4) 標(biāo)準(zhǔn)品處理：確保標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，避免沉淀或未混合均勻。

5) 洗板：正確進(jìn)行洗板，避免過(guò)度或不完全洗板導(dǎo)致背景升高。

6) 顯色時(shí)間：注意觀察顯色梯度，及時(shí)終止，避免過(guò)時(shí)導(dǎo)致褪色。

6、顯色結(jié)果解讀：

1) 顏色變化：TMB由藍(lán)轉(zhuǎn)黃，OPD直接生成橙黃色。

2) 吸光度讀取：通常使用450nm波長(zhǎng)讀取吸光度，有時(shí)需用到650nm（如TMB氧化后的DAP）。

7、避免背景過(guò)高：

1) 正確洗滌：確保每次洗滌充分，避免殘留。

2) 底物保護(hù)：底物避光保存，防止污染和氧化。

3) HRP稀釋?zhuān)?/font>嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)苊鉂舛冗^(guò)高。